Fluorescencijski filtar bitna je komponenta fluorescentnog mikroskopa. Tipičan sustav ima tri osnovna filtra: pobudni filtar, emisijski filtar i dikroično zrcalo. Obično su pakirani u kocku tako da se skupina zajedno umetne u mikroskop.
Kako radi fluorescentni filter?
Filtar uzbude
Uzbudni filtri propuštaju svjetlost određene valne duljine i blokiraju druge valne duljine. Mogu se koristiti za proizvodnju različitih boja podešavanjem filtra da propušta samo jednu boju. Pobudni filtri dolaze u dvije glavne vrste — dugopropusni filtri i pojasni filtri. Eksciter je obično pojasni filtar koji propušta samo valne duljine koje apsorbira fluorofor, čime se minimizira pobuđivanje drugih izvora fluorescencije i blokira pobudno svjetlo u pojasu emisije fluorescencije. Kao što je prikazano plavom linijom na slici, BP je 460-495, što znači da može proći samo kroz fluorescenciju od 460-495 nm.
Postavlja se unutar putanje osvjetljenja fluorescentnog mikroskopa i filtrira sve valne duljine izvora svjetlosti osim raspona pobude fluorofora. Minimalni prijenos filtra diktira svjetlinu i briljantnost slika. Preporuča se najmanje 40% prijenosa za bilo koji pobudni filtar tako da je prijenos idealno >85%. Širina pojasa pobudnog filtra trebala bi biti u potpunosti unutar raspona pobude fluorofora tako da središnja valna duljina (CWL) filtra bude što bliža vršnoj valnoj duljini pobude fluorofora. Optička gustoća (OD) pobudnog filtra diktira zatamnjenost pozadinske slike; OD je mjera koliko dobro filter blokira valne duljine izvan raspona prijenosa ili propusnosti. Preporuča se minimalni OD od 3,0, ali idealan je OD od 6,0 ili veći.
Filtar emisije
Svrha emisijskih filtara je omogućiti da željena fluorescencija iz uzorka dopre do detektora. Blokiraju kraće valne duljine i imaju visok prijenos za duže valne duljine. Vrsta filtra također je povezana s brojem, npr. BA510IF na slici (filtar za zaštitu od smetnji), ta se oznaka odnosi na valnu duljinu pri 50% maksimalne transmisije.
Iste preporuke za filtre pobude vrijede za filtre emisije: minimalni prijenos, propusnost, OD i CWL. Emisijski filtar s idealnom kombinacijom CWL, minimalnog prijenosa i OD daje najsvjetlije moguće slike, s najdubljim mogućim blokiranjem i osigurava detekciju najslabijih signala emisije.
Dikroično ogledalo
Dihroično zrcalo postavljeno je između pobudnog filtra i emisijskog filtra pod kutom od 45° i reflektira pobudni signal prema fluoroforu dok emitira emisijski signal prema detektoru. Idealni dikroični filtri i razdjelnici snopa imaju oštre prijelaze između maksimalne refleksije i maksimalne transmisije, s >95% refleksije za širinu pojasa pobudnog filtra i transmisiju od >90% za širinu pojasa filtra emisije. Odaberite filtar imajući na umu presječnu valnu duljinu (λ) fluorofora kako biste smanjili zalutalo svjetlo i maksimizirali omjer signala i šuma fluorescentne slike.
Dikroično zrcalo na ovoj slici je DM505, nazvano tako jer je 505 nanometara valna duljina pri 50% maksimalnog prijenosa za ovo zrcalo. Krivulja transmisije za ovo zrcalo pokazuje visoku transmisiju iznad 505 nm, strm pad transmisije lijevo od 505 nanometara i maksimalnu refleksiju lijevo od 505 nanometara, ali još uvijek može imati nešto transmisije ispod 505 nm.
Koja je razlika između dugopropusnih i pojasnih filtara?
Fluorescencijski filtri mogu se podijeliti u dvije vrste: dugopropusni (LP) i pojasni (BP).
Dugopropusni filtri odašilju velike valne duljine i blokiraju one kraće. Granična valna duljina je vrijednost pri 50% vršnog prijenosa, a sve valne duljine iznad granične vrijednosti prenose dugopropusni filtri. Često se koriste u dikroičnim zrcalima i emisijskim filtrima. Dugopropusni filtri trebali bi se koristiti kada aplikacija zahtijeva maksimalno prikupljanje emisija i kada spektralna diskriminacija nije poželjna ili neophodna, što je općenito slučaj za sonde koje generiraju jednu vrstu emitiranja u uzorcima s relativno niskim razinama pozadinske autofluorescencije.
Pojasni filtri odašilju samo određeni pojas valne duljine, a blokiraju druge. Oni smanjuju preslušavanje dopuštajući prijenos samo najjačeg dijela spektra emisije fluorofora, smanjuju šum autofluorescencije i tako poboljšavaju omjer signala i šuma u uzorcima autofluorescencije s visokom pozadinom, što filtri dugog prolaza ne mogu ponuditi.
Koliko vrsta kompleta fluorescentnih filtera BestScope može isporučiti?
Neke uobičajene vrste filtara uključuju plave, zelene i ultraljubičaste filtre. Kao što je prikazano u tablici.
| Set filtera | Filtar uzbude | Dikroično ogledalo | Zaštitni filtar | Valna duljina LED lampe | Primjena |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Metoda fluorescentnih antitijela ·Acidinska narančasta: DNA, RNA ·Auramin: bacil tuberkuloze ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | DM570 | BA575 | 535 nm | · Rodamin, TRITC: Metoda fluorescentnih antitijela ·Propidij jodid: DNA · Zahtjev za ponudu |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | · Auto-fluorescentno promatranje ·DAPI: DNA bojenje ·Hoechest 332528, 33342: koristi se za bojenje kromosoma |
| V | BP400-410 | DM455 | BA460 | 405 nm | ·Kateholamini ·5-hidroksi triptamin ·Tetraciklin: Kostur, Zubi |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Kompleti filtara koji se koriste u prikupljanju fluorescencije dizajnirani su oko glavnih valnih duljina koje se koriste u aplikacijama fluorescencije, što se temelji na najčešće korištenim fluoroforima. Zbog toga su i nazvani prema fluoroforu za koji su namijenjeni za snimanje, kao što su DAPI (plava), FITC (zelena) ili TRITC (crvena) filtarske kocke.
| Set filtera | Filtar uzbude | Dikroično ogledalo | Zaštitni filtar | Valna duljina LED lampe |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramin | BP470 | DM480 | BA485 | 450 nm |
| Teksas crveno | BP540-580 | DM595 | BA600-660 | 560 nm |
| mTrešnja | BP542-582 | DM593 | BA605-675 | 560 nm |
Kako odabrati fluorescentni filter?
1. Načelo odabira fluorescentnog filtra je pustiti fluorescentno/emisiono svjetlo da prođe kroz kraj snimanja što je dalje moguće i potpuno blokirati pobudno svjetlo u isto vrijeme, kako bi se dobio najveći omjer signala i šuma. Osobito za primjenu mikroskopa s višefotonskom pobudom i potpunom unutrašnjom refleksijom, slabi šum također će uzrokovati velike smetnje u učinku slike, tako da je zahtjev za omjer signala i šuma veći.
2. Poznavati ekscitacijski i emisijski spektar fluorofora. Za konstruiranje kompleta fluorescentnih filtara koji generira visokokvalitetnu sliku visokog kontrasta s crnom pozadinom, filtri pobude i emisije trebali bi postići visoku propusnost s minimalnim mreškanjem pojasa propusnosti u područjima koja odgovaraju vrhovima pobude fluorofora ili emisijama.
3. Uzmite u obzir trajnost fluorescentnih filtara. Ovi filtri moraju biti nepropusni za intenzivne izvore svjetlosti koji generiraju ultraljubičasto (UV) svjetlo koje bi moglo dovesti do "pregorjevanja", posebno filtra pobude jer je izložen punom intenzitetu izvora osvjetljenja.
Različite fluorescentne uzorke slika
Resursi su prikupljeni i organizirani na internetu, a koriste se samo za učenje i komunikaciju. Ako postoji bilo kakvo kršenje, kontaktirajte nas za brisanje.
Vrijeme objave: 9. prosinca 2022